Attana Cell 200 蛋白互作分析仪——基于全细胞的生物大分子相互作用分析系统 瑞典 Attana 公司制造的 Attana Cell 200 蛋白互作分析仪，是一种无需标记、高灵敏度、可直接在细胞表面测量分子相互作用的生物传感器，可测定蛋白与 DNA、RNA、启动子、转录因子、肽段、抗体、多糖、酶、细菌、病毒、细胞、组织切片等各类生物大分子之间的相互作用，其填补了传统生物传感器与基于细胞的分析方法之间的空白，可用于亲和力、动力学、免疫原性、浓度定量、分子垂钓、生物类似药一致性评价等实验中。目录Attana 核心优势 Attana 操作流程实例 1、检测蛋白药物与肿瘤组织切片的亲和动力学实例 2、研究抗体药曲妥珠单抗与 SKOV3 细胞的亲和力实例 3、用于多克隆抗体的动力学和亲和力的检测和计算实例 4、无需纯化抗体，直接对杂交瘤上清液进行筛选和鉴定Attana 参考文献 Attana 蛋白互作分析仪依托的石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，简称 QCM）技术，发展始于上世纪 60 年代初期，是一种非常灵敏的质量检测工具，其测量精度可达纳克级，比灵敏度在微克级的电子微天平高 1000 倍，理论上可以测到的质量变化相当于单分子层或原子层的几分之一，其利用了石英晶体的压电效应，外加的交流电势使石英晶体在共振频率下震动，当分子流经晶体并与表面结合，振动频率会发生变化，其频率差异可以用来反映实时的分子相互作用。 自 2010 年上市以来，Attana Cell 200 蛋白互作分析仪已广泛用于蛋白互作、蛋白细胞互作、抗体药研发等领域，赢得了包括大学、药企、CRO 实验室的信任，与制药化工巨头Lonza 集团、胰岛素研发明星诺和诺德等长期合作。 相比传统分子互作检测技术，Attana 开创了直接在细胞层面进行实时原位分子结合动力学的检测方法，更准确地反映了体内环境的分子间互作，能够高质量、精确地研究其特异性、动力学和亲和力。 Attana Cell 200 蛋白互作分析仪检测优势1、可检测蛋白与细胞的相互作用2、可检测蛋白与组织切片的相互作用3、可检测细胞与细胞的相互作用4、可使用粗制蛋白样品 Attana Cell 200 蛋白互作分析仪实验操作流程举例（蛋白-细胞互作分析）一、实验材料1.PBS-Phosphate-buffered salt pH 7.4。2. 水——用于 Attana Cell 200 蛋白互作分析仪的所有水必须是高质量的水（18.2MΩ，0.2μm 过滤）。3.Attana Cell 200 蛋白互作分析仪。4. 适当的阳性和阴性对照分析物。5. 适当的参考细胞系。 二、实验流程2.1 贴壁细胞——铺细胞2.2.1 细胞生长和观察1.COP- 1 表面——细胞优化的聚苯乙|烯表面。 Attana 蛋白互作分析仪芯片。2. 培养基——用于特定细胞系的任何合适的细胞培养基。3. 胰蛋白酶-EDTA 溶液。4. 贴壁细胞——可以在标准细胞培养物中生长的任何细胞系都可以在 COP- 1 表面上生长。2.2 悬浮细胞——捕获细胞1.LNB-羧基表面——低非特异性结合羧基表面。 Attana 蛋白互作分析仪芯片。2.Amine coupling kit——EDC（1 -乙基- 3 - [3 -二甲基氨基丙基]——碳二亚胺盐酸盐），磺基-NHS（N-羟基磺基琥珀酰亚胺），乙醇氨（1M，pH8.5）。3. 固定化缓冲液——例如 0.1M 乙酸钠 pH4.5。4. 捕获分子（如 ConA 等）——参见注释 6.5. 悬浮细胞——任何不粘附于标准细胞培养物的原代细胞或细胞系。 该方法也适用于贴壁细胞。2.3 固定细胞1. 甲醛-新鲜制备的 3.7% 无甲醇甲醛。2.4 观察细胞1.DAPI- 40,6 -二脒基- 2 -苯基吲哚，3μM。2. 荧光显微镜。3. 其他染色——见注 10。2.5 相互作用实验1. 待测样本。2.10 mM 甘氨酸 pH 3。3.10 mM 甘氨酸 pH 2。4.10 mM 甘氨酸 pH 1.5。5.20 mM 甘氨酸 pH 1.5。6. 含有 1M NaCl 的 10 mM 甘氨酸 pH 3。7. 含有 3M NaCl 的 10 mM 甘氨酸 pH3。8.1 mM NaOH。9.10 mM NaOH。10.100 mM NaOH。11. 含有 3M NaCl 的 1 mM NaOH。12. 含有 3M NaCl 的 10 mM NaOH。13. 含有 3M NaCl 的 100 mM NaOH。14.0.005%SDS。15.0.01%SDS。 三、实验方法1. 所有溶液必须采用优质水（18.2MΩcm，0.2μm 过滤）制备。2. 当通过溶解固体（例如粉末或粉末）制备溶液时，必须使用 0.2μm 过滤器进行过滤（参见注 1）。3. 应轻轻完成所有移液操作，同时避免移液器吸头与传感器表面接触。4. 传感器表面绝对不能干燥。 更换缓冲液或进行清洗时，务必留下少量液体，足以覆盖表面。5. 尽可能覆盖表面，以防止灰尘沉积在表面上。3.1 贴壁细胞——铺细胞1. 按照使用说明准备 COP- 1 芯片表面。2. 按照标准细胞传代方法获取细胞（参见注释 2）。3. 在培养基中将细胞稀释至适当的细胞密度（见注 3）。4. 向 COP- 1 培养室中加入 700μL 细胞悬液。5. 轻轻地上下吹打悬浮液一次，以确保细胞均匀分布。6. 将传感器芯片置于适当的条件下，使细胞生长至少 1 个细胞周期（见注 4）。3.2 悬浮细胞——捕获细胞1. 将捕获分子溶解或稀释在合适的固定缓冲液中（见注 5）。2. 将捕获分子固定在 LNB-羧基表面上（见注 6）。3. 将传感器表面（即金芯片）转移到 COP- 1 支架上。4. 连接培养室。5. 准备最终密度为 2×106 细胞/ mL 的细胞悬液（以 PBS 重悬）（见注 7）。6. 移取 50μL 细胞悬浮液到捕获表面，确保其覆盖整个表面。7. 在室温下孵育细胞 30 分钟。3.3 固定细胞（可选，见注释 8）1. 从培养室中弃去细胞培养基或缓冲液。2. 用 PBS 轻轻吹打冲洗细胞两次。3. 在室温下用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。4. 在室温下用不含甲醇的甲醛 3.7% 固定细胞 10 分钟（见注 9）。5. 用 PBS 轻轻吹打两次。6. 在室温下用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。7. 向培养室中加入 700μL PBS。芯片可以在 4℃ 下储存数天。3.4 观察芯片表面的细胞在此阶段，可以使用荧光显微镜评估表面覆盖率。1. 在室温下用 3μM DAPI 孵育细胞 5 分钟（见注 10）。2. 弃去 DAPI。3. 用 PBS 轻轻吹打冲洗细胞三次。4. 去除大部分液体，只留下足以覆盖表面的液体。5. 取下培养室。6. 在荧光显微镜下观察以评估细胞密度（见注 11）（图 2）。7. 安装测量盖。8. 使用移液器，通过将移液管尖端「插入」两个流动池孔中的一个，用流动缓冲液轻轻地填充流动池（见注 12）。此时芯片表面已准备好用于上机，但可以在 4℃ 下在湿度室中储存数天。 3.5 互做实验双通道系统可用于评价和减去与传感器表面的非特异性结合。不表达特异性受体的细胞可用作对照。强烈建议使用对照来分析与芯片表面和除靶点之外的细胞膜组分的非特异性相互作用（见注释 13）。 还建议在分析物注射循环之前和之后（即，在数据收集之前和数据收集之后，而不是在每个循环之间）使用阳性和阴性对照样品注射。1. 用 Running Buffer 运行仪器，使液体充满管路（参见注释 14）。2. 将芯片插入 Attana 蛋白互作分析仪。3. 将流速设置为 20μL/ min，启动。4. 将温度设置为所需的值。5. 使基线稳定（即基线漂移小于 0.2 Hz / min，持续 10 分钟）。这通常需要至少 4 小时，最多可能需要 24 小时。6. 以下述方法确定待测样品的浓度：从 0.1 KD（如果 KD 已知）或 5 μg/ mL（如果 KD 未知）开始注入分析物，并且每次进样浓度增大 2 倍，直到检测不到显著的信号增加。用此方法测定的分析物浓度范围，其通常接近 0.1KD 至 10KD 的范围。7. 准备再生溶液（见注 15）。8. 按步骤 6 将样品注入最大浓度的一半。9. 如果之前做过实验，请从最可能的再生解决方案开始。否则，请从注释 15 中列表中的第一个解决方案开始。10. 以短脉冲式注入再生溶液（酸性溶液 30 秒，碱性溶液或洗涤剂 10 秒）。如果除去分析物不完全（即信号部分返回基线），则增加再生时间（见注释 16）。如果分析物没有或只有极少量的被去除，请进入列表中的下一个再生溶液。11. 按步骤 6 将样品注入最大浓度的一半。12. 每次步骤 10 之后要再生表面。13. 重复步骤 11 和 12 共计五次。最后 3 个循环必须显示相同的结合水平（见注 17）（图 4）。14. 确定适当的因子稀释度，以跨越步骤 6 的分析物浓度范围，同时具有五种不同的浓度。15. 用稀释分析物，按步骤 14 准备分析物稀释行。包括相同数量的空白注射（见注 18）。16. 用 Running Buffer 清洗蛋白互作分析仪环。17. 注入随机空白，结合时间为 105 秒，解离时间为 300 秒（对于强结合物，解离时间可能更长）。18. 按步骤 16 注入相应的样品。19. 每步骤 6 重新再生。20. 用 Running Buffer 清洗蛋白互作分析仪环路。21. 重复步骤 17 - 20，直到分析完所有样品。22. 现在可以使用 Attester Evaluation（Attana）和/或 TraceDrawer（Ridgeview）分析数据（图 5）。 4. 注释1. 如果不能用 0.2μm 过滤器过滤溶液。在这种情况下，使用 0.45μm 过滤器进行过滤也行，但是有可能增加堵塞仪器管道的风险。2. 使用贴壁细胞之前，建议至少将细胞传代两次。使用标准方法（例如，胰蛋白酶-EDTA 处理）消化收集细胞。3. 标准细胞密度为 60,000 - 120,000 个细胞/ mL。通常，建议使用较高的细胞密度，只要细胞均匀分布在溶液中即可。调节细胞密度的目的是确保细胞覆盖率为 80% 以实现高灵敏度，同时防止细胞多层叠在一起。4. 细胞必须贴壁牢固。芯片上加入细胞后可以在培养箱培养过夜，细胞融合度不应超过 80%。5. 合适的固定缓冲液应该具有较强的缓冲力并且 pH 值比待固定分子的 pI 低 1。此外，它不应该破坏或导致待固定分子的不可逆构象变化。6. 使用胺偶联试剂盒时，仔细按照说明书操作，在 LNB-羧基表面上实现捕获分子的高密度或饱和覆盖。可以多次注射捕获分子，直至达到饱和。好的捕获分子应该能与细胞表面分子强结合。其他标准是捕获分子在测定期间应该是稳定的并且不与分析物相互作用。常见的选择包括抗体和凝集素。7. 可以使用多种缓冲液进行细胞稀释，只要它不含有抑制捕获分子与其靶标之间相互作用的成分即可。8. 细胞固定有利有弊。优点是固定的细胞更稳定，能进行更长时间的实验并有更好的信噪比。缺点包括改变活性位点的风险。为了尽量减少这种缺点，必须注意尽可能温和的固定细胞，如注释 [10] 所述。9. 在室温下用 3.7% 甲醛固定 10 分钟是一个很好的开始。如果需要更温和的固定剂，降低甲醛浓度或使用冷甲醛在冰上或 4℃ 下进行固定。也可以使用其他交联剂，例如戊 2 醛。10. 可以使用任何核酸染色剂。也可以使用表面染色，但建议在测定前除去染色剂或确认染色剂不会影响细胞表面和目标分子之间的相互作用。11.80% 的细胞融合度是一个很好的目标。融合度降低会降低灵敏度。12. 填充细胞小室时，确保没有气泡，这会减少基线稳定需要的时间。用 Running Buffer 轻轻地冲洗流动池，可以去除气泡。如果没有清除气泡，可能需要拆下并重新安装检测盖。13. 选择与实验组尽可能接近的对照。对照的优先顺序是（1）具有变体无活性靶标的相同细胞系（例如，突变体），（2）不存在靶分子的相同细胞系（例如，敲低），（3）其他完全不同的不表达靶分子的细胞系或没有任何细胞的芯片。14.Attana 蛋白互作分析仪可以使用各种 Running Buffer。它可以是简单的缓冲液，如 PBST 或 HBST，或更多含有蛋白质含量的粗缓冲液，如血清或培养基。运行缓冲区还可以包含阻断剂，如 BSA 或酪蛋白。15. 在随后的分析周期开始之前，执行表面再生以去除剩余的分析物。再生过程必须结合细胞及其表位的有效性和保存。找到满足这些标准的再生解决方案必须根据经验对每种类型的交互对进行。然而，通常可以在使用相似分子种类的实验中找到指导。要优化再生条件，请从温和的再生溶液开始。如果没有去除分析物，则需要尝试更严格的解决方案。以下再生条件可用作细胞传感器表面的指导：10 mM 甘氨酸 pH 3 - 20 mM 甘氨酸 pH 1.5,10 mM 甘氨酸 pH 3 - 20 mM 甘氨酸 pH 1.5 含 1 - 3 M NaCl，1 mM 至 100 mM NaOH，1 mM 至 100 mM NaOH，3M NaCl，0.005% 至 0.01%SDS。16. 通过以 20 s 增量（最多 50 s）和/或重复进样增加脉冲长度，可以增加接触时间。不要将接触时间增加到 100 秒以上。17. 在样品再生注射的前几个循环期间，灵敏度初始降低是很常见的。最后三次注射的结合水平必须相似。如果连续进样的响应差异减小，但尚未达到 0，则重复小标题 3.5，步骤 11 和步骤 12，直到进样足够稳定或副标题 3.5，步骤 11 和步骤 12 重复总共十次。18. 用 Running Buffer 做空白对照（样品也用 Running Buffer 稀释）。 Attana 蛋白互作分析仪应用实例 1、检测蛋白药物与肿瘤组织切片的亲和动力学长久以来，将癌症组织用甲醛固定石蜡包埋（FFPE）后做组织切片，进行免疫组化（IHC）分析，是癌症相关抗原的标准检测方法。但免疫组化本身很难定量抗体与癌症相关抗原结合的特异性和亲和力。Clausen 等人建立了一套以 Attana Cell 200 QCM 技术为核心，直接在组织切片上进行实时原位分子结合动力学的检测方法。 研究者直接在 FFPE 人胎盘组织、乳腺癌和前列腺肿瘤标本中，测定了 rVAR2 蛋白与它的胎盘样硫酸软骨素（pl-CS）受体之间的相互作用，发现 rVAR2 与 FFPE 人胎盘、肿瘤组织存在纳摩尔级的亲和力，与 pl-CS 阴性的正常组织无相互作用。 进一步用雄激素受体 N- 20 的抗体（抗 AR）对此方法进行评估，发现 Attana 得出的 KD 值与可用抗原表位的数量无关，表明 Attana 不仅能在组织标本上直接对抗原-抗体结合亲和力进行定量，还能评估抗体所能识别的抗原表位的数量。 基于这些结果，研究者认为 Attana QCM 技术不仅可用于挑选诊断和治疗中的最佳生物制剂，还能用于开发新型高亲和力的药物。（Clausen, T. M., et al. Real-time and label free determination of ligand binding-kinetics to primary cancer tissue specimens; a novel tool for the assessment of biomarker targeting. Sens Biosensing Res. 2016; 9: 23 - 30.）图 1.Attana Cell 200 蛋白互作分析仪与 COP- 1 检测芯片。图 2. 免疫组化鉴定为阳性的甲醛固定石蜡包埋组织样品被切成 5μm 厚的薄片，并固定在 COP- 1 芯片中心。图 3.（b）Attana 测定出 rVAR2 蛋白与胎盘组织的 KD 值为 4.27nM，具有高亲和力。（c）当添加了能抑制 rVAR2 粘附于胎盘组织的 CSA 溶液后，rVAR2 蛋白与胎盘组织的结合曲线不再有明显的结合点和解离点。图 4.（a）免疫组化结果显示，与作为正常组织对照的扁桃体组织切片相比，rVAR2 蛋白与乳腺癌、前列腺肿瘤组织切片有强相互作用，进一步用 Attana 测定其 KD 值分别为 8.9nM 和 6.65nM，而与扁桃体组织的结合曲线无明显的结合点和解离点，无法测出其 KD 值。（b 和 c）用 V5 -FITC 的抗体对 rVAR2 蛋白进行定位，进一步验证了 Attana 得到的结果，即 rVAR2 蛋白与前列腺肿瘤组织切片强结合，而不与扁桃体组织结合。证明 Attana 能准确对组织切片上抗原-抗体的亲和力进行定性和定量。图 5. 检测发现纯化的胎盘样硫酸软骨素（pl-CS）受体与 rVAR2 蛋白的 KD 值为 3.6nM，具有强结合，证明 Attana 可准确检测纯化蛋白间的相互作用。图 6. 将乳腺癌细胞 (SKBR3)、前列腺癌细胞 (LNCap) 与中国仓鼠卵巢细胞（CHO）相比，免疫组化和 Attana 的结果一致，乳腺癌细胞与前列腺癌细胞均检测到细胞与 rVAR2 蛋白有着很强的亲和力。图 7. 高表达 AR 的 Lncap 细胞与 AR 抗体有强的亲和力，而雄激素非依赖的 PC3 与 AR 抗体的亲和力相对较弱。这一结果进一步在细胞水平上证明了 Attana 具有广泛的兼容性。图 8. 采用 Attana 对 AR 抗体与 FFPE 组织切片的亲和力检测结果，与免疫组化结果一致，即免疫组化阳性的 FFPE 前列腺癌组织，对 AR 抗体有强的亲和力，免疫组化阴性的 FFPE 胎盘组织，对 AR 抗体无相互作用。这一结果在组织切片水平上也证明了 Attana 能有效监测抗体与切片的结合。 实验操作总结：①组织切片如何固定在 COP- 1 芯片上？Attana 的 COP- 1 芯片在室温用聚 L-赖氨酸溶液包被 5 分钟。包被后，用 PBST 冲洗芯片，并在室温干燥 2 小时。将甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样品切成 5μm 厚的薄片，并贴在芯片上，60℃ 烘烤 1 h。②脱蜡和抗原修复将 COP- 1 芯片上的组织样品浸没在 EZprep 溶液中，65℃ 水浴 30 min 进行脱蜡。之后 PBS 洗 3 次。再在 95℃ 下，用 pH6.0 的 10 mM 柠檬酸钠、0.05% 吐温溶液浸泡 30 min 进行抗原修复。  实例2、研究抗体药曲妥珠单抗与 SKOV3 细胞的亲和力在抗体药物研发中，检测抗体与细胞的结合非常重要。使用石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，简称 QCM），研究单克隆抗体曲妥珠单抗与表达人表皮生长因子受体 2（HER2）的卵巢腺癌上皮细胞（SKOV3）的亲和，是一项非常新颖的技术。 Elmlund 等人的实验结果揭示出曲妥珠单抗与 SKOV3 细胞结合的平均解离常数 KD 值为 7±1nM。实验过程中对细胞固定程序和接种密度等进行优化非常重要，为抗体药的亲和力研究提供了一种新方法。与纯化的抗原抗体的结合相比，抗体与靶细胞的结合更为自然。 这些结果证明了在药物开发中使用基于全细胞的 QCM 分析，用于筛选靶向 HER2 的候选药物的潜力。（Elmlund, L., et al. Study of the interaction of trastuzumab and skov3 epithelial cancer cells using a quartz crystal microbalance sensor. Sensors, 2015; 15(3): 5884–5894）图 1. 赫赛汀抗体与 SKOV3 细胞表面 HER2 受体（蓝色）结合的示意图。将 SKOV3 细胞培养并固定在 Attana Cell 200 蛋白互作分析仪的 COP- 1 检测芯片上，然后在其上注射赫赛汀，观察振动频率的变化，实时测定赫赛汀与细胞膜上的 HER2 亲和力。图 2. 用不同浓度的甲醛（FA）和戊 2 醛（GA）对 COP- 1 芯片上 SKOV3 细胞进行固定后，采取 DAPI 染色。荧光显微镜观察发现，随甲醛（FA）浓度的升高，固定在芯片上的细胞也越多；而随戊 2 醛（GA）浓度的升高，固定在芯片上的细胞的数量不变或者稍有减少。后续实验选择 3.7% FA 和 0.5% GA 对芯片上的细胞进行固定。图 3. 采用 3.7% 甲醛（FA）固定芯片上 SKOV3 细胞，注射 20 μg/mL 赫赛汀后，Attana 蛋白互作分析仪绘制出了一条结合点和解离点均很明显的结合曲线。图 4. 采用 0.5% GA 戊 2 醛（GA）的固定方法时，虽然频率改变很大（达到 17 Hz 左右），但是在解离阶段，曲线迅速下降、很快回复到基线类似水平，这一结果代表此时的结合很弱或发生了非特异性结合。因此，0.5% GA 戊 2 醛（GA）固定对本次实验不合适。图 5. 对比不同浓度的 FA 固定，2% 浓度固定时，最大反应频率随抗体浓度增加并没有增加，因此有可能是芯片的非特异性结合。而 5% 浓度固定时，最大反应频率虽然与抗体浓度基本成比例增加，但是波动较大。在结合 5% 浓度固定时，染色较亮，这时很可能也发生了非特异性结合。因此后续实验选择 3.7